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文獻速遞丨naica?微滴芯片數字PCR系統與CRISPR基因編輯技術強強聯合


歐洲分子生物學實驗室研究人員Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等在bioRxiv分享了一項基于CRISPR方法優化的技術文章,目的在于提升從基因編輯產生的細胞中篩選純合子的效率。眾所周知,使用CRISPR精確敲入 (knock-in) 外源性DNA后,產生的基因編輯克隆需要嚴格的篩選才能得到目的克隆(純合子)。基于常規PCR和Southern Blot檢測目的克隆的方法耗時長、需要大量勞動力。因此研究人員對傳統方法進行了優化,采用熒光標記蛋白和naica數字PCR聯合的方法,精準快速的實現了基因編輯后目的克隆的篩選,大大降低了檢測的人力、物力、時間成本。

亮點:

?  采用數字PCR和熒光標記的方法,可以在基因組編輯的早期階段進行檢測,整個流程只需要大約3-4小時即可獲得結果,能夠及時停止“不理想”的編輯克隆的培養,節省人力物力成本。

?  數字PCR方法只需要檢測少量的細胞,相較于Southern Blot大大減少樣本制備時間。

?  基于naica®微滴芯片數字PCR系統的多重檢測能力和Crystal Miner軟件的熒光補償校正功能,能夠快速、可靠的對CRISPR編輯細胞進行定量篩選檢測。

文章內容分享

背景原理介紹:

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats),規律間隔成簇短回文重復序列,是一種RNA引導的基因組編輯技術,能對基因進行精確性敲除,敲入,替換等,從而實現探究基因功能,修復致病基因等目的。但是,CRISPR技術也會導致有潛在危險的“脫靶”問題,帶來不可預測的基因變化,因此對于CRISPR基因編輯的脫靶情況需要靈敏且精準的驗證及檢測。

▲CRISPR結構示意圖

研究目的:

提升從基因編輯產生的細胞中篩選純合子的效率。

傳統方法篩選目的克隆的局限性:

基因編輯后,篩選純合子的方法是生成雜合克隆后,通過輪次迭代產生純合子,整個過程耗時甚至能長達一年,且容易發生脫靶修飾。使用常規PCR區分純合克隆和雜合克隆的方法只能檢測到目的基因,還需要金標準Southern Blot檢測脫靶整合的情況,然而,Southern Blot是一種耗時且低通量的技術,需要相對大量的基因組DNA和細胞材料,這些材料的制備會浪費大量的時間和人力成本。

優化后的新方法:

針對上述問題,Moritz Kueblbeck等人優化了CRISPR的實驗流程,改進了CRISPR的轉染效率,通過添加熒光標簽蛋白實現CRISPR編輯的克隆菌落中相關標記蛋白的正確亞細胞定位,并通過dPCR 來定量目的基因和脫靶基因組編輯事件。通過該方法,快速、可靠的對熒光標記CRISPR編輯細胞進行了定量篩選。【見下圖】


▲Moritz Kueblbeck等人優化的CRISPR純合子篩選實驗流程

▲PCR進行兩種細胞系中的標簽基因檢測。U2OS- TPR-SNAP標簽基因整合總數檢測 (左);

HK- Nup93-mEGFP標簽基因整合總數及目的標簽基因檢測(右)。矩形圖代表克隆,每個紅點代表一次測量結果。

對于多重熒光檢測實驗,進行熒光溢出的補償校正是十分必要的。本研究使用naica®微滴芯片數字PCR系統進行多重檢測,并使用Crystal Miner軟件進行熒光補償校正分析,確保每一個熒光基團被單一檢測通道捕獲,得到的結果精準可靠。

如想對熒光補償校正有更多了解,請復制下方鏈接地址到瀏覽器進行查看:http://dx.doi.org/10.1016/j.bdq.2016.10.002

原文鏈接如下:https://doi.org/10.1101/2021.06.23.449557


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naica®微滴芯片數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司的naica®微滴芯片數字PCR技術在進行核酸檢測時具有獨特的優勢。系統利用cutting-edge微流體創新型芯片—Sapphire芯片(或高通量Opal芯片)作為數字PCR過程的唯一耗材。樣品通過毛細通道網格以30,000個微滴的形式進入2D芯片中。3色熒光檢測儀器,整個流程只需要兩個半小時,并可進行數據的質控和結果追溯分析,獲得的數據真實可靠。

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